作者：陈亚兰

真核生物组织是异质的，从生物样品中获取的组织包含多种类型细胞，当想要获取某一类型组织或细胞样品，研究该样品DNA、RNA或蛋白质我们就需要一种精准的利器能够准确地分离出目标区域。激光显微切割系统就是能够完美解决这一问题的利器。

DNA Analysis Workflow Steps

接下来以平台现有的Leica LMD7000为例，讲述其原理以及操作流程。

LMD 7000 显微镜主机

01 Leica LMD7000原理

非接触式，重力收集样品  利用可移动的激光精准切割目标区域，目标样品因重力作用掉落在管盖上，而后将获取样品进行后续DNA、RNA或蛋白质分析。

激光显微切割原理模式图

激光光路核心部件 

除激光强度、激光脉冲可调外，激光光路中有几个主要部件Scanner unit、Aperture Diaphragm和Offset lens来确保激光垂直切割样品、调整激光切割直径粗细以及调整激光焦点位置。尽可能让每个样品可调至最优切割参数。

the laser Axis

the Scanner Unit

the Aperture Diaphragm 

the Offset Lens

02 操作流程

1、开机，按序启动显微镜控制器、激光控制器、电脑以及软件。

2、TL-BF明场切割过程：

① 样品放置：点击样品夹unload，选择样品夹类型(玻片式或小皿式)，放上样品，磨面朝下，点击continue，样品夹退回机器；

样品夹与其放置位置

② 收集管放置：点击收集管unload，选择收集管类型，安装收集管，收集管可选0.5mL或0.2mL的PCR管，点击continue，收集管退回机器；

收集管放置

③ 软件中选定收集管盖/孔：选择收集管盖/孔 (如下图软件界面左下，选择A、B、C或D)；

软件界面

④ 软件点击Microscope Control，选择TL-BF，选择物镜，一般切割大的区域选择5X或10X，如果是单细胞20X、40X、60X，如果切割亚细胞器或染色体用150X；

⑤找到样品焦面，如图像效果不好，可点击Camera菜单下的Camera Setup Window...，调整采集参数，优化图像质量；

⑥找到目标区域，选择Single(单区域)或者Multiple(多区域)，选择Draw+Cut，画出要切割的区域(线段，椭圆，矩形等)，在Shape List中可以看到绘制参数；

⑦ 激光切割：点击Laser下的Laser Control，调节激光的设置，开始可以把Power低一点，切割的Aperture小一点看看效果，摸索条件，Specimen Balance(切割至最后一点的弹力)调到0。点击Start Cut开始切割。如果切割不好，优化激光参数(参数说明见下图)；

激光控制面板与参数调整说明

区域绘制与切割 Draw+Cut 模式

⑧ 切割结束后，点击collector，查看收集管中收集的样品，找到样品，点击收集管unload，取出收集管，进行后续实验。

管盖上收集的样品5倍与10倍物镜

3、荧光切割模式的方法 类似TL-BF，需Microscope Control中选择FLUO。并选择匹配的滤光片。

荧光信号样品切割

03 Something Special

冰冻切片适合做DNA、RNA和蛋白质分析。RNA首选冰冻切片，一般建议切片厚度5-25um。石蜡切片适合做DNA，形态保存更好，但会造成RNA，蛋白质降解，一般建议切片厚度5-15um。

制作切片的膜材料耗材分为玻璃和钢框架结构，其中玻璃耗材可使用5X-60X物镜，钢框架可使用5-150X物镜。

活细胞小皿耗材为底部只有膜结构的塑料小皿。

观察收集管盖中样品需用低倍物镜，可采用5X-20X物镜。

部分植物样品可直接切割，推荐制作冰冻切片。

膜材料耗材(A)、OCT包埋的植物芽组织(B)与PET膜片上的植物切片(C)

资料参考：

https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/p/leica-lmd7/

https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-018-1352-z