作者：曹慧珍

很多时候，Z-序列需要和多点或时间序列连用，但这时会遇到很多问题！

我们想象中样品是整齐的排列在小皿里

直接设定Top、Bottom、Step，ND窗口中勾选Z、XY、T，Run Now开始采集图像就好啦。

但是样品通常长这样：

样品在小皿上的高度并不相同，如果直接设定Top、Bottom，采集的厚度将会翻倍，浪费大量时间。

另一种Z轴范围选定方法就发挥作用了

1、ND Acquisition窗口XY选项卡下记录样品的XYZ信息（Z需要是3D stack的中间面）；

2、ND Acquisition窗口Z选项卡下勾选黄色漏斗状图标；

3、设定样品step和总厚度；

4、点击run now开始采集图像序列。

样品的总厚度和每个点的中间焦面可通过设定top和Bottom的方法获得，立方体中间的数值即中间面。

这种方法工作原理：先到达记录的XYZ位置，根据中间面Z计算出三维序列的起始面，开始采集三维序列，然后到达另一个XYZ位置，计算出新的Z轴起始面，采集另一个三维序列，循环往复。

还有的样品更任性：

样品不止在小皿上的高度不同，它们自己的厚度也相差很大，这时候用上面的方法拍，range需要由最厚的样品决定，比较浪费时间，

NIS-element有终极武器ND Sequence Acquisition

1、鼠标右击软件上的空白部分，从弹出的菜单中选择[Acquisition Controls] -> [ND Sequence Acquisition]以调出对话框。

2、点击add添加一个ND程序，新弹出一个类似ND Acquisition的窗口

3、XY选项卡下记录位置信息，Z选项卡下按照top、bottom的方法或找中间面的方法设定Z轴扫描范围；

4、点击OK；

5、回到ND Sequence Acquisition主窗口，add添加另外的ND程序，多次重复此步骤；

6、勾选[Time lapse]设定时间序列；

7、run now启动程序。

有过细胞timelapse拍摄经验的小伙伴都知道，细胞会发生热漂移现象，必须打开PFS系统才能实现长时间的拍摄，XY选项卡下记录每个点的锁焦面，以该面作为relative去采集多点三维时间序列，然而细胞往往是贴壁的，锁焦面通常是细胞中信号最为清晰的焦面，而非中间面。

这个时候我们可以选择另一种方式设定Z轴扫描范围，先调焦确定最清晰的焦面（锁焦面）和top/bottom之间的距离，然后打开PFS，XY选项卡下记录位置焦面高度信息，Z选项卡下，分别设定向上向下扫描厚度，然后设定step，开始ND程序采集。

XY-Z-T程序略复杂，大家有需求可以预约辅助实验哦！

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