扫一扫关注微信公众号

扫一扫关注微信公众号

李雪明课题组在《结构生物学报》上发表论文报道一种利用聚焦离子束制备蛋白微晶电子衍射样品的技术
2019/02/21 225

2019年2月20日,清华大学生命学院李雪明课题组在《结构生物学报》(Journal of Structural Biology)杂志上在线发表题为《利用聚焦离子束制备微晶电子衍射样品切片》(Using Focus Ion Beam to Prepare Crystal Lamella for Electron Diffraction)的研究论文。该研究为电子衍射技术提供了一种新的样品制备方法,弥补了以往样品制备方法中的局限,拓展了电子衍射技术的使用范围。

利用微晶电子衍射技术(MicroED)解析晶体结构日益成为冷冻电子显微学(cryoEM)的一个重要分支。由于电子与物质具有很强的相互作用,电子衍射可以用来解析X射线同步辐射光源无法解析的亚微米级别的微小晶体的结构。然而,极强的电子与物质相互作用也限制了晶体厚度不能超过0.5微米,过厚的晶体会导致电子不能透射或产生严重的动力学散射效应,使得衍射点的强度产生偏差而难以解析结构。为了达到电子衍射要求的样品厚度,现有样品制备方法通常是筛选小晶体或者利用机械力将大块晶体破碎,寻找晶体较薄的边缘用于收集数据,然而这种方法具有很多不可控因素,在现实中难以操作,且易对脆弱晶体造成损伤。

李雪明课题组借鉴了已在冷冻电子断层成像(cryoET)中应用的聚焦离子束(FIB)切割技术,使用汇聚的离子束对大块晶体进行切割,使之满足电子衍射的厚度要求,成功制备了高质量的晶体切片,并将两个测试蛋白的结构解析到1.5  和1.7  ,基本消除了电子衍射对晶体大小的限制。同时,李雪明课题组还研究了聚焦离子束切割对晶体造成辐照损伤,发现从单一方向对晶体喷镀Pt保护层难以覆盖多面体形状晶体的全部表面,从而导致严重的表面辐照损伤。实验发现,从双束扫描电镜(SEM/FIB)的电子束和离子束两个方向喷镀可以有效减少辐照损伤。利用FIB切割可以控制样品厚度的特性,本研究发现晶体切片的最佳厚度范围为150-250nm,过薄的样品通常比较脆弱,容易在转移的过程中损坏,而过厚的样品易于发生动力学散射效应,导致分辨率和衍射数据质量明显下降。此外,本研究还探索了晶体切片的微小形变对电子衍射花样和强度的影响,为后续研究铺垫了道路。本研究解决了电子衍射样品制备的技术瓶颈,将有力地推进电子衍射技术在蛋白质或者有机分子晶体的结构测定中的更广泛应用,弥补现有X射线衍射晶体学技术的不足,甚至可以作为一种更低成本和更高分辨率的技术来替代传统的X射线衍射晶体学技术。

清华大学生命学院李雪明研究员为本文的通讯作者,清华大学生命学院四年级博士生周珩、罗智璞博士(现任苏州大学分子酶学研究所教授)为本文共同第一作者。

国家蛋白质科学中心(北京)清华大学冷冻电镜平台为本研究的样品制备和数据收集提供了支持,清华大学冷冻电镜平台的李晓敏博士和李丹阳对样品制备提供了技术帮助。国家自然科学基金委、科技部重点研发计划、北京市结构生物学高精尖创新中心、清华-北大生命科学联合中心为本研究提供了经费支持。

论文链接:https://doi.org/10.1016/j.jsb.2019.02.004


图1 聚焦离子束蛋白质微晶切割、优化及结构解析流程图


原文链接:

http://life.tsinghua.edu.cn/publish/smkx/11191/2019/20190221133021021766492/20190221133021021766492_.html

返回列表
预约登录
联系我们