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转盘共聚焦显微镜介绍
2020/03/14 721

细胞影像平台

点扫描激光共聚焦显微镜大家都比较熟悉了,相信做细胞及荧光成像的用户基本都用过激光共聚焦显微镜,即使自己没有独立使用过也听过自己实验室的同学使用过吧。然而随着显微成像和细胞标记技术的提高,大家已不再满足于对细胞静态结构的描绘,大家希望看到细胞内部或者细胞与细胞之间连续发生的动态变化过程。转盘式共聚焦显微镜的出现为科研工作者提供不论是免疫荧光样品的拍摄、组织及固定样品的拍摄还是活细胞样品的快速拍摄提供了极大的方便,使快速荧光样品拍摄成为可能。

转盘式共聚焦显微镜通过多点同步扫描的方式,大大提高了扫描效率,缩短了单点滞留时间,借助微弱的激发光照射就可以实现高灵敏度的成像效果,目前转盘式共聚焦显微镜大多采用的是双转盘共聚焦系统,该系统有一个微透镜转盘和一个针孔转盘组成,转盘上分布有20000个螺旋排列的针孔,每一个针孔微透镜和转盘都是一一对应的,激光通过透镜系统会形成一个圆斑,这个圆斑会覆盖大约1000个微透镜的的范围(即扫描区域),当光线通过微透镜聚光后,会穿过每一个小孔,形成微光束,这1000个微光束再经过显微镜光路照射到样品上,会同步激发1000个光信号,这些信号会沿着显微镜光路返回,当他们再次穿过小孔就会实现共聚焦过滤,所得到的焦平面的信号再通过两个转盘之间的二向色镜转移到相机(CCD/cmos)上,由于微透镜和小孔在转盘上以螺旋状分布,随着转盘的转动(针孔位置随之改变),实现对样品不同区域的的完整扫描(如图1)。其结果是速度比传统的共聚焦快10到20倍,无需等待逐点逐线形成图像。

图1. 转盘共聚焦显微镜工作原理图

细胞影像平台目前有两套转盘共聚焦显微镜系统,每套系统都有各自的特点及优势,下面以其中一套转盘共聚焦显微镜为例进行介绍:

转盘共聚焦显微镜特点:

1、大视野,13mm X 13mm 成像视野;2、速度快,支持最大采集速度400帧/秒;3、高速成像,100fps@2048 X 2048分辨率, 400fps@512 X 512 分辨率;4、双共聚焦针孔 40um/25um,可以根据实验目的选择不同针孔;5、基于GPU运算的高速去卷积,可以边拍摄边进行图像去卷积处理;6、有两种成像方式:激光照明的widefield成像,用于极高速及极弱光成像及共聚焦成像;7、成像视野均匀度≥95%,大图拼接效果更佳。

转盘共聚焦显微镜应用及应用举例:

转盘共聚焦显微镜应该比较广泛,基本传统点扫描激光共聚焦显微镜能完成的实验在转盘工具集显微镜上都能实现。可以进行固定样品拍摄、免疫荧光样品拍摄、组织切片样品拍摄、活体组织样品拍摄、活细胞样品拍摄、大组织样品快速拍摄、活细胞样品快速拍摄等。

下面我们举几个应用实例感受一下他的魔力:

1、大的特殊材料及荧光微球的拍摄

图2. 透明材料里荧光微球拍摄

该图是利用转盘共聚焦显微镜拍照特殊透明材料里培养的荧光小球,利用GFP和DesRed进行标记材料和应该微球,利用4x物镜,拍摄厚度300um,30stacks,拍摄视野 2048 X 2048,5 x 6大视野拼接,用时约2min。有没有感觉速度很快,图像很炫酷呀。

2、芯片通道里培养细胞样品拍摄

图3. 芯片通道里培养细胞样品

该样品利用GFP和TRITC标记的细胞分别培养在芯片材料里,来观察不同区域细胞分布。该图像利用10X 物镜,利用488、561两个激光通道,拍摄视野2048 x 2048,进行大视野(4x3)拼接,拍摄厚度50um ,20 Z-Stacks,用时约4min,比用传统共聚焦显微镜速度提高约10倍。

如果对细胞样品进行统计的话,也是非常方便快捷的。比如用户想统计在一定范围内神经细胞的个数激分布,我们利用转盘共聚焦进行大视野拍摄之后很容易就得到我们想要的结果。

3、细胞样品拍摄

图4. 固定细胞样品拍摄

该图利用40倍油镜,用405、488、561三个通道进行拍摄,拍摄厚度10um,20 Z-stacks,拍摄视野2048 x 2048,进行大视野(3 X 3)

拍摄,用时约20S得到高分辨清晰的图像,既可以得到清晰的图像,也可以高效的得到神经细胞的分布及个数。

当然,除了可以进行细胞、组织样品的拍摄,也可以对细菌、酵母、胚胎,植物及活体组织进行快速高效拍摄。而且不仅拍摄速度快,淬灭程度低,对样品损伤也比较小。

4、细菌样品拍摄

图5. 细菌样品拍摄

该图是对细菌样品,利用100X油镜,561通道,拍摄厚度Z=1,拍摄视野2048x 2048,用时约300ms进行的快速拍摄。由于细菌样品对光比较敏感,利用该仪器,在非常短的时间完成拍摄,减少了光的长时间照射对样品造成的漂白及淬灭。

当然应用实例非常多,没办法给您一一列举。看到上面的实验,有没有感觉很神奇,有没有想体验一下,等疫情过去,赶快约起来吧。如果有问题请随时联系我们。

本文章版权归清华大学蛋白质研究技术中心细胞影像平台所有

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