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蛋白质制备与鉴定平台AKTA蛋白纯化仪介绍
2020/05/16 287

作者:芦亚菲

随着第一台快速蛋白液相色谱FPLC的发展,AKTA已经成为生物分子纯化技术平台的代名词,并且现在已经生产出AKTA avant,AKTA pure系列等产品,AKTA慢慢变成了生物分子纯化领域缺一不可的技术支撑。AKTA能够快速分离纯化多种生物分子,不论是来源于人类还是动物、植物、微生物,能够纯化分离包括各种蛋白质例如天然蛋白质、重组和融合表达蛋白质、抗原抗体等以及多肽、寡核苷酸、质粒、病毒、小分子等。使用AKTA还可以进行生物大分子的规范化纯化,纯化实验设计,药物蛋白的分离,蛋白质的定性等。

介绍了这么多AKTA的用途,是不是很想了解一下平台的AKTA为以后的样品纯化做准备呢?下面我们从平台现有的AKTA类型、层析柱类型、使用注意事项等方面为大家一一做介绍,相信大家会对我们平台的AKTA有个比较初步的了解,方便以后的使用。但由于篇幅有限,我们很难把我们知道的所有内容都罗列出来,而且想了解每项技术都是需要花时间去学习和实践的。同时作为仪器管理员我们也在不断的学习与改进中,相信共同学习才是我们的共同目标,后续我们也会有相关的技术帖继续发出。


一、平台AKTA类型介绍

目前平台拥有AKTA以下系列: Purifier 10 plus、Purifier 100、Purifier 10、Micro AKTA、Pure L、avant以及pilot等,具体的仪器介绍详见表1。目前平台的多台AKTA属于比较经典的AKTA purifier系列,此系列产品目前已经停产,在市面上已经看不到这款灰色的AKTA了。AKTA purifier能够快速分离纯化生物分子,同时平台具有配套的层析柱和编辑的方法模板可以进行分子筛凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等,此外AKTA purifier配有组份收集器Fra-920和 Fra-950,具有峰收集功能,可通过控制软件UNICORN来进行样品收集。

表1、平台5种常用AKTA基本简介


二、平台层析柱介绍

目前平台配有各种类型层析填料及各种规格的层析空柱壳,包括亲和层析填料Ni、GST、MBP等,离子交换层析填料例如DEAE Sepharose FF、CM Sepharose FF、SP Sepharose 4 FF、Q Sepharose 4FF等。空柱壳包括COLUMN XK 26/20 、COLUMN XK 50/30、TRICORN 10/100 COLUMN 等。另外,平台还提供多种预装柱,详见表2。

表2、平台现有预装柱信息汇总


三、AKTA使用注意事项

1、离心过滤:

样品需13000rpm离心10min,buffer需0.22微米的滤膜过滤后,方能使用。另外,如果样品有颜色请提前告知管理员。

2、正确接柱:

液液相接,防止柱子进空气。拧紧螺母,防止漏液。选好柱位,防止泵洗液流入柱子。如图1所示,一定要从上样阀1出来的线接柱子的上端,再找一根线将柱子的下端和UV检测器相连。上样阀1接柱子上端,2和6接Loop环(进样环),3接injector 进样针,4和5是waste,7连接在线滤膜。

3、压力保护:

给柱子设定流速的同时一定要设置好限压!如图2所示,如果将7连接在柱子的上端,洗泵的时候柱子会因压力过高而炸裂!预装柱很贵重,尤其是分子筛,像图2中的分子筛每一根的购买成本都在2万元左右,所以一定要小心使用。

4、进样:

选择合适体积的进样环并正确接到仪器上,进样前一定要检查是否漏液,执行进样命令之前一定要先将样品打入到样品环且不要将注射器拔下来。当使用样品环上样(5ml)以内时方法如下:

(1)将合适的上样环连接于上样阀的2号和6号口上,用注射器抽取buffer从上样口推入,冲洗进样环多遍;

(2)将离心过的样品推入进样环,注意不要推入气泡,并将注射器保留在样品阀上不要拔下来;

(3)按照Flowpath-injectionvalve-inject-execute执行进样;

(4)待上样完成后(完全上样通常为2倍以上的进样环体积),将上样阀位置改为load状态,点execute执行,完成上样,当然也可以等到程序结束再改为load状态。

5、延迟体积:

由于紫外检测器到收集管流出口是有一段连线的,而这段连线的内径体积就是所谓的延迟体积Delay Volume,所以是先有紫外信号,后收集样品。而延迟体积的多少关系着我们样品出峰位置和收集管的对应位置以及收集管样品的取舍。图3中两个样品的紫外峰图和SDS-PAGE图能够让大家直观的感受一下设置与不设置延迟体积的区别。图3a未设置延迟体积,则默认延迟体积为0,这样就会导致AKTA紫外峰图显示的样品出峰位置和对应的收集管发生了错位,大概有0.5-1mL之间的位移,而这错位的体积正好就是仪器的延迟体积,这就需要我们收集样品的时候要按照紫外峰图向后多收集0.5-1mL。图3b设置了比较准确的延迟体积,我们可以看到AKTA紫外峰图显示的出峰位置和收集管中的样品基本上是一一对应的。所以如果设置了延迟体积大家收集样品的时候记得往峰的后面多收几管别都扔了减少样品的损失。

6、进样环以及柱子的清洗:

不及时清洗进样环,长时间没人用的话残留在进样环中的样品结晶析出粘到环上,下一次上样可能产生很大的阻力,影响下一个人进样。而不及时清洗层析柱的话,留在柱子里的缓冲液中的一些成分可能会析出堵塞柱子,影响下一次的正常使用。类似这些不当操作都可能增加管理员维修维护仪器和柱子的时间成本,总之善后事宜要做好。


四、结语

有关我们平台的AKTA就介绍到这里,大家如果想要使用我们平台的AKTA记得提前联系我们管理员预约时间培训。另外除了AKTA我们平台还有很多蛋白质性质鉴定分析仪器例如AUC、ITC、MST、BLI、CD等等可供大家学习使用,非常欢迎大家多多关注和使用平台的仪器。


本文章版权归清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质制备与鉴定平台所有

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