作者：陈宇凌

图1 溶液内酶解和胶内酶解步骤

基于质谱技术的蛋白质化学平台为用户提供包括常规蛋白质鉴定、蛋白修饰鉴定、蛋白NC端分析、定量蛋白质组学分析、修饰蛋白质组学分析、完整蛋白分子量精确测量以及H/D交换质谱分析等。除后两者外，前几项分析都需要对蛋白进行酶解前处理，将蛋白消化成肽段，以便于质谱测序分析。酶解前一般需要对溶液内或胶内的蛋白进行二硫键还原，并对蛋白中的巯基进行烷基化修饰（图1）。经典的流程中还原和烷基化分两步进行，耗时约1.5小时，是不是可以将这两步操作合并，实现一步还原和烷基化的反应呢？答案当然是肯定的！下面我们就来看看，二硫键还原和烷基化里藏着的小窍门！

酶解前处理一般需要还原蛋白中的二硫键，破坏蛋白结构来加强酶解的效率。常用的还原剂一有二硫苏糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）。为了阻止还原后的自由巯基再次形成二硫键，我们经常使用烷基化试剂将巯基封闭，常用的烷基化试剂有碘乙酰胺（IAM，iodoacetamide）、氯乙酰氨（ClAM，chloroacetamide）、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺等。

1.二硫键还原剂

DTT是苏糖醇的C-1及C-4位羟基置换成巯基的化合物，如图2所示，常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可阻止蛋白质中的半胱氨酸之间形成蛋白质分子内或分子间二硫键。DTT有两个巯基基团，还原二硫键的作用能维持3-7天，其还原状态下为线性分子，被氧化后变成包含二硫键的六元环状结构。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的还原力也随之降低。

TCEP是一种无色、无味、易溶于水的弱还原性物质，在空气和水溶液中具有较高稳定性。TCEP属于三价膦系衍生物，其还原二硫键的原理是其中心原子P所带的孤电子对能与氧原子形成配位共价结合而具有还原性。TCEP具有很多DTT所不能比拟的好处，其对还原二硫键选择性极强，除半胱氨酸外，几乎没有与其它氨基酸的副反应，最重要的是，能在更宽的pH范围内（可以低至pH3）使用，还原能力强于DTT，作用可维持2-3周。

图2 DTT和TCEP的分子式

从图2的结构中，我们很容易看出，DTT上的巯基也会和烷基化试剂反应，因此为了防止DTT在还原二硫键之前就被烷基化试剂中和，DTT和烷基化试剂不能同时加入到蛋白溶液或者蛋白胶中；但是，TCEP由于还原原理不同于DTT，可同时和烷基化试剂一起加入，并且作用更强更稳定，是一种高效地还原二硫键的DTT替代物。

2.巯基烷基化

图3 碘乙酰胺可以在赖氨酸上添加分子量和双甘氨酸标签类似的修饰[1]

将组蛋白使用SILAC标记，轻标组蛋白使用碘乙酰胺修饰，重标组蛋白不使用碘乙酰胺修饰，混合后酶解，可看到肽段VTIAQGGVLPNIQAVLLPK*K (*, 泛素化修饰位点)在HPLC上有两个分子量近似峰，第一个峰在重标和轻标样品中都存在，即泛素化修饰肽段；第二个峰只存在于轻标样品中，即赖氨酸被碘乙酰胺修饰的肽段。

氯乙酰氨，和碘乙酰胺类似，是一种针对半胱氨酸特异性更强的烷基化试剂[2]。已有报道证明，氯乙酰胺能够有效烷基化巯基，并且不产生双甘氨酸类似修饰，如图4所示。

图4 氯乙酰胺不与赖氨酸残基反应

将组蛋白使用SILAC标记，轻标组蛋白使用碘乙酰胺修饰，重标组蛋白使用氯乙酰胺修饰，混合后酶解，可看到肽段VTIAQGGVLPNIQAVLLPK*K (*, 泛素化修饰位点)在HPLC上有两个分子量近似峰，第一个峰在重标和轻标样品中都存在，即泛素化修饰肽段；第二个峰只存在于轻标样品中，即赖氨酸被碘乙酰胺修饰的肽段。

说了这么多，其实操作就很简单了。在进行胶内酶解的二硫键还原和烷基化步骤时，向干燥的蛋白胶粒中加入含有10 mM TCEP和25 mM氯乙酰胺的50 mM碳酸氢铵溶液，避光常温反应30min，蛋白的还原烷基化即可大功告成！

参考文献：

1.Michael Nielsen, Michiel Vermeulen, Tiziana Bonaldi, Jurgen Cox, Luis Moroder and Matthias Mann. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods, 2008, 5: 459-460.

2.Knut H. DAHL and John S. McKINLEY-McKEE. The imidazole-promoted inactivation of horse liver alcohol dehydrogenase. Bioorg. Chem., 1981, 10: 329-341.

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