作者：王乐乐
蛋白质晶体学是利用蛋白质及其复合物晶体的X射线衍射数据来分析生物大分子三维精细结构的学科，主要研究步骤分为蛋白质及其复合物的结晶筛选，晶体优化和测试，收集高分辨率的晶体衍射数据，最终通过数据解析得到蛋白质分子的三维结构。其中蛋白质结晶和优化过程均需要大量的条件筛选和繁杂的Buffer配制，通过全自动化、高通量的设备可为结晶筛选繁复的试验过程提供快速简便的技术支持。文章主要对蛋白质结晶筛选工作站Mosquito的硬件和软件进行详细的介绍，并针对使用过程中可能出现的各种问题，给用户提出一些注意事项。关于利用这台设备进行蛋白质结晶筛选的一些技术应用方法如坐滴法，悬滴法，Seeding实验方法，添加剂实验方法以及LCP方法等，将在以后的文章陆续给大家介绍。
第一部分：蛋白质结晶筛选工作站Mosquito仪器和软件介绍
TTP LabTech的Mosquito蛋白质结晶筛选工作站主要功能是实现对蛋白样品、筛选液和LCP混合物的纳升级别的精确吸取和加样，加样的范围为25纳升到1200纳升，一次性针头，无交叉污染。总时间最快可以达到2分钟/板，加样针的机械定位可达0.1 mm，加样针的下探深度为13毫米，针头定位准确，池液可精确覆盖蛋白样品。
Mosquito仪器的硬件方面，其型号配置有很多种，主要区别在于板位数的不同和是否带有LCP加样的功能模块，根据用户的不同需求可以自定义设备的型号配置。如下面的图片所示，是Mosquito的几种不同型号配置。图1-1是两板位不带LCP功能模块；图1-2是五个板位不带LCP功能模块；图1-3是四板位带有LCP功能模块；图1-4是两板位带有LCP功能模块；平台设备属于这一型号配置，同时还配有加湿罩，在干燥的环境中保证湿度。
按照四板位带LCP功能模块的配置为例，主要部件如下图1-5所示，包括一次性加样针卷，加样头，LCP加样泵，LCP加样针，板位台区等部件。仪器的一次性加样针的主要构造如图1-6所示，由一个密闭的高密度聚乙烯管以及内置其中的不锈钢活塞组成，工作时加样头驱动可编程的活塞移动，安全的吸取和分配液体溶液。LCP功能模块的主要构造如图1-7所示，包括高精度加样驱动，气密容积式注射器，加样针。
Mosquito的工作原理是采用高精度的步进电机，驱动内径0.4 mm的加样针，采用容积式置换的方式实现纳升级的加样操作，过程为：新的加样针在加样头处就位；电机驱动活塞移动，液体吸入加样针内；板位移动使加样针精确对准目标微孔；电机驱动活塞移动，液体分配到目标微孔中；用过的加样针从加样头出移除。
图1-5：设备的主要组成部件
Mosquito仪器的软件方面，根据不同型号，软件中对应的板位也会相应变化，具体以平台的设备为例，软件中的板位对应的就是硬件中的板位，如下图1-8所示。
图1-8：平台Mosquito设备软件中setup界面中的板位图
Mosquito的软件界面风格简单明了，主要分为setup和protocol两个界面。如图1-8所示，在setup界面中左边一列Available plates显示的是定义到仪器中的各种板子的型号以及蛋白条适配器和蛋白条的型号。平台最常用三种品牌的坐滴板和一种品牌的悬滴板，这些板子以及蛋白条适配器在Mosquito软件系统中都有定义的型号名称，具体参照下面的表格1所示。
表格1：平台的各种板型与仪器软件中定义的型号和微孔编号对照表
界面的右边可以看到3个区域（position），分别对应着仪器硬件的两个板位区和中间的蛋白条区域。板位1（Plate position 1）和板位3（Plate position 3）是可以选择板子型号和蛋白条适配器的，蛋白条适配器有两种蛋白条体积2微升和5微升可以选择，区域2（position 2）是只能放蛋白条的，只有2微升和5微升蛋白条型号可以选择。在选择框下面还有一个空白的框，可以自行填写一些标记信息，比如标记蛋白浓度，名称，大小，板子池液的名称等等信息。
在Mosquito软件的protocol界面中，如图1-9所示，在窗口最上面任务栏中的+号表示添加一个程序，×号表示删除一个程序，下面黄色那一行显示的是整个程序使用的针数，接着下面一行中从左边开始的是Transfer，这一列都是进行移液的方法设置，主要包括Aliquot，copy等等，在之后的文章中具体介绍不同的应用方法时会详细介绍这些设置的具体含义。
Source部分是进行吸取液体的位置信息设置，包括：position指从板位区域1，2，3中的哪一个开始吸取液体；Start指从该位置区域的板子的第几列开始吸取液体；End是指吸取到哪一列后就结束吸取；Row指从哪一行开始吸取，由于仪器本身是按照每列8根针在同时吸取液体，而不是按照每行来执行的，所以这一参数都是灰色无法设置的；Sub well是针对96孔结晶板的微孔排布数量来设置的，这一设置指的是从哪一个孔吸取液体，因为每种板子型号装池液的孔的位置可能是不一样的，所以在设置时需要根据板子型号选择正确的参数。平台常用品牌的晶体板的微孔在软件中对应的Subwell编号，蛋白条适配器在软件中对应的开始或者结束的列编号，请参照上面的表格1，96孔晶体板在软件中对应的开始或者结束的列编号就按照板子本身的标记从左到右依次是1-12。
Destination部分是进行液体排出的位置信息设置，这部分需要设置的内容同Source部分一样，就不再赘述。
在Liquid部分要设置的内容包括Volume移液体积，体积范围根据转移类型大小不同，一般是25纳升到1.2微升，如果是Multi-Aspirate，可吸取最小体积是20纳升，主要用于Seeding或者添加剂的实验方法。Dispence Type是指针排出液体的方式，包括Contact和dropplet。dropplet 相当于单道枪的第二档，先打出来液体，再让液滴接触到板子上；Contact就是针直接接触到板子再加样，目前所有默认点样就是这种。
图1-9：Mosquito软件的Protocol界面
以Swissci的板型为例，每板点一个蛋白样品，那么可以按照如图1-10来编辑Protocol。
第一步移液方式选择Aliquot，从position 1中蛋白条适配器1号蛋白条中吸取样品，依次分装到position 3中96孔座滴板的1到12列的3号孔中。第一步换针的方式选择Between transfer，在这一步过程中将不换针，进行下一步移液的时候再换针，也可以选择Never。而加样体积可以根据自己蛋白样品量的多少来确定，此例中选择200纳升体积。
第二步移液方式选择copy，从position 3中96孔板的1号孔中吸取一列池液加样到3号孔中，依次每列都如此加样。第二步换针的方式选择Always，每次吸取的池液都是不同的，必须每次加样都换针，因此总消耗针数为104根。
图1-10：采用Swissci 96-3板进行一种蛋白结晶筛选的Protocol
第二部分：蛋白质结晶筛选工作站Mosquito使用时的注意事项
1、仪器上方的指示灯的含义：
仪器上方的指示灯左边为蓝灯用来指示控制软件是否打开，右边为绿灯用来指示仪器是否进行了初始化。开机的时候仪器的指示灯并不会亮，只有打开电脑中的Mosquito控制软件，才会左边蓝灯常亮，右边绿灯闪动，初始化之后才会右边绿灯常亮。这时表示软件连接成功。如果初始化之后，关闭控制软件，左边蓝灯熄灭，左边绿灯依然常亮。有些用户不清楚指示灯的含义开机后发现指示不亮就误以为是仪器有故障了，其实仪器是正常的。仪器正常状态时，软件右下角会显示绿灯和Ready字样（一般被登录小窗口遮住了，移开就可以看到了）；如果出现红灯和Error字样，这时才表示仪器是有问题的，需要及时联系管理人员来解决。
2、移动板位时的注意事项：
仪器的板位模块在断电的状态时是可以随意左右的滑动的，但是如果仪器一旦处于开机状态，那么切勿随意手动移动板位模块，否则会导致短路，电机错位，烧坏电路板等等危害仪器的后果。正确的操作是在软件中点击Park Left和Park right来进行移动。由于仪器经过初始化后板区位置处在中间，刚好被点样头挡住，通常不方便放板子，所以这一操作会经常用到。
3、加湿的问题：
仪器的加湿罩上方的两边是两个小型加湿器，如果软件加湿时没有水蒸汽出来，除了开关没有开和加湿器没有水这两个原因之外，最容易出现的原因是因为加湿器水加的太满导致的，这时只需要把水倒掉一些就可以了。小型加湿器如图2-1所示。
图2-1：加湿罩中的小型加湿器
4、放置板子的注意事项：
在仪器的板位区，放置蛋白条适配器时需要确保方向不要放反，这个问题初次使用设备的用户通常会出现，正确的方向如图2-2（a）所示。此外，放置96孔晶体板的时候，也要确保正确的方向，如图2-2（b）所示。此外，放板子的时候要注意板位区右下角的卡扣要卡住板子，如果是松动的状态，放置板子的时候要对准左上角，板位进行移动的时候会自动卡住板子。此外，放置板子之前要保证板位区的干净整洁，没有微小异物，否则会导致板子凹凸不平，也会影响到加样的准确性。
图2-2：放置板子的正确方向
5、使用不同板型时的注意事项：
在实验时一定要根据实际使用的板子和蛋白条在软件中选择相对应的板型和型号，确保无误，否则会导致加样错误，实验失败。如果是自带的板子，务必提前通知工作人员把板子型号定义到仪器里面再使用。不建议用户自行修改板子的参数，以免影响其他用户的使用。另外，如果使用的是平台分装好的板子，一定要记得在运行加样之前把封膜撕掉，否则导致无法加样，甚至撞针和仪器故障。
本文章版权归清华大学蛋白质研究技术中心X射线晶体学平台所有
