作者：王乐乐、范仕龙

Mosquito在蛋白质晶体学研究中主要用于高通量蛋白结晶条件的微量加样和筛选，可以实现坐滴、悬滴、seeding、additive、LCP等等多种实验方法的应用。在之前的文章中已经详细介绍了Mosquito如何采用坐滴法和悬滴法进行蛋白结晶筛选的一些具体应用，本文将主要详细介绍Mosquito采用基于坐滴法的seeding，Additive方法进行蛋白结晶筛选的技术应用，LCP方法的应用将在以后文章中单独详细介绍。

第一部分：Mosquito采用seeding方法进行蛋白结晶筛选的技术应用

1、采用96孔坐滴板进行一种蛋白的一种seeding实验的Protocol：

以Swissci的96孔坐滴板为例，如果每板点一个蛋白样品，同时还要添加一种seed，那么可以Setup界面按照图1下方所示来设置板型和蛋白条型号（同时图1上方还标记出了蛋白条适配器中蛋白样品和seed的位置编号以及晶体板的样品微孔的位置编号，这些位置编号都需要在Protocol界面中设置）。

图1：Setup界面设置板型和蛋白条型号

按照图2-4来编辑Protocol。具体为：第一步从position 1中5微升规格蛋白条适配器的1号蛋白条中吸取250微升蛋白溶液样品加到position 3中晶体板的每一列2号微孔中，从左到右依次加样1-12列，换针方式选择Between transfer，如图2所示，这一步消耗8根针。

图2：Protocol中第一步加蛋白样品

第二步选择Multi-Aspirate的方式，从position 2中2微升规格的蛋白条中吸取25nL的seed溶液并不加样，如图3所示，接着进行第三步吸取第一列池液，然后一起加样到position 3中晶体板的第一列2号微孔中，从左到右依次加样1-12列，完成seeding实验，如图4所示，这两步消耗96根针，总消耗针数104根。

图3：Protocol中第二步吸取seed溶液

图4：Protocol中第三步吸取池液加样到晶体板的微孔中

2、采用96孔坐滴板进行2种蛋白的2种seeding实验的Protocol：

以Swissci的96孔坐滴板为例，如果每板点2个蛋白样品，同时还要分别添加2种seed，那么可以按照图5在Setup界面下方所示来设置板型和蛋白条适配器型号（同时图5上方还标记出了蛋白条适配器中蛋白样品和seed的位置编号以及晶体板的样品微孔的位置编号，这些位置编号都需要在Protocol界面中设置）。

图5：设置板型和蛋白条适配器型号

按照图6-11来编辑Protocol。其中，图6-8为第一步至第三步1号蛋白和seed实验的程序编辑，具体为：第一步从position 1中5微升规格蛋白条适配器的1号蛋白条中吸取250微升1号蛋白溶液样品加到position 3中晶体板的每一列2号微孔中，从左到右依次加样1-12列，换针方式选择Between transfer，如图6所示，这一步消耗8根针。

图6：Protocol中第一步加1号蛋白样品

第二步选择Multi-Aspirate的方式，分别从position 1中5微升规格蛋白条适配器的2号蛋白条中吸取50nL的1号seed溶液并不加样，接着进行第三步吸取position 3中晶体板的第一列池液，然后一起加样到position 3中96孔晶体板的第一列2号微孔中，从左到右依次加样1到12列，完成seeding实验，这两步消耗针数96根，如图7和8所示。

图7：Protocol中第二步吸取1号seed溶液

图8：Protocol中第三步吸取池液加样到晶体板2号微孔中

按照图9-11编辑第四步至第六步2号蛋白和seeding实验的程序，具体为：第四步从position 1中5微升规格蛋白条适配器的3号蛋白条中吸取250微升2号蛋白溶液样品加到position 3中晶体板的每一列3号微孔中，从左到右依次加样1-12列，换针方式选择Between transfer，如图9所示，这一步消耗8根针。

图9：Protocol中第四步加2号蛋白样品

第五步选择Multi-Aspirate的方式，分别从position 1中5微升规格蛋白条适配器的4号蛋白条中吸取50nL的2号seed溶液并不加样，接着进行第三步吸取position 3中晶体板的第一列池液，然后一起加样到position 3中96孔晶体板的第一列3号微孔中，从左到右依次加样1到12列，完成seeding实验，这两步消耗针数96根，如图10和11所示。总消耗针数为208根。

图10：Protocol中第二步吸取2号seed溶液

图11：Protocol中第三步吸取池液加样到晶体板3号微孔中

3、其他各种情况的Protocol：

用户可以根据自己的需求进行自定义设置Protocol，一般根据蛋白的数量，seed的种类，以及需要加样的区域来自定义。比如有的用户想在一整板的前1-6列加一种seed，后7-12列加另外一种seed等等情况，都可以实现相应的Protocol编辑。如果有问题也可以找工作人员进行设置。

第二部分：Mosquito采用additive方法进行蛋白结晶筛选的技术应用

如果用户的添加剂就一种那么可以采用上面seeding的Protocol，只要把seed溶液换成添加剂溶液就可以了。如果用户购买的是96个条件的添加剂试剂盒，可以先将添加剂加在Mosquito软件系统中定义过的96孔板里，比如TTP的96孔池液板，那么就可以通过编辑相应的Protocol来实现自动化的添加剂实验方法的应用了。

以Swissci的坐滴板为例，每板点1个蛋白样品，同时还要添加96个条件的10×的添加剂，那么可以按照图12在Setup界面下方所示来设置板型和蛋白条型号（同时图12上方还标记出了蛋白条中蛋白样品位置编号以及晶体板的样品微孔的位置编号，这些位置编号都需要在Protocol界面中设置）。

图12：Setup界面设置板型和蛋白条型号

按照图13-15来编辑Protocol。具体为：第一步选择Aliquot，从Position 2中的5微升规格的蛋白条中吸取200nL样品加到Position 3中坐滴板每一列的2号微孔中，如图13所示。

图13：Protocol中第一步加蛋白样品

第二步选择Multi-Aspirate，从position 1中的96孔池液板里吸取第一列40nL的添加剂不加样，接着进行第三步copy从Position 3中坐滴板第一列的1号微孔中继续吸取200nL池液，一起加样到Position 3中坐滴板第一列的2号微孔中，从左到右依次加样1到12列，完成添加剂的实验，这两步消耗针数96根，总消耗针数为104根，如图14-15所示。

图14：Protocol中第二步吸取添加剂溶液

图15：Protocol中第三步吸取池液加样到晶体板2号微孔中

最后在文章结尾附上平台各种试剂盒分装板的信息，平台目前有十几种可溶性蛋白的晶体筛选kit，5种膜蛋白的筛选Kit以及两种核酸的筛选Kit，约2000多个条件，这些Kit均通过平台的Tecan公司的配液工作站Freedom提前分装到96孔晶体板中，方便用户使用，具体的试剂盒名称，品牌和两种结晶筛选分装板型对应编号如下面的附表所示。

附表：平台各种试剂盒名称品牌和两种结晶筛选分装板型对应编号表