作者：张彦丽

FRET（荧光共振能量转移）是指能量从一种受激发的荧光基团转移到另一种荧光基团的物理现象。前者称为供体，后者称为受体，当两个荧光染料足够靠近时（两个分子相互作用时）发生FRET，激发态的供体以非辐射的方式将部分能量转移到受体，使受体被激发发射荧光，而自身的荧光淬灭。FRET的产生必须具备两个条件，一是供体的发射光谱和受体的激发（或吸收）光谱必须有部分重叠；另外供体和受体之间的距离必须足够小（一般小于10nm）。

FRET的实现方法用激光共聚焦来实现的话有有比例法、受体漂白法、敏化发光法三种方法。本文以使用较多的受体漂白法为例，通过FV10-ASW4.2软件，来了解一下FRET实验操作流程。

首先要明确样品所用的染料蛋白。确定好之后仪器会自动匹配激发和发射波长。将实验参数调节好。然后进入Sitmulus setting界面开始进行目标区域选择与漂白。

选择Main界面进行漂白区域的的选择与调节，如下图：

可以对选择区域形状，漂白方式（普通方式、龙卷风方式）、扫描速度、漂白所用激光强度，漂白开始方式（自动、手动）漂白时间等条件进行条件摸索。一般不同样品需要的激光强度和漂白时间不同，一般建议先手动方式进行摸索，

找到适合的漂白时间及激光强度，然后再选择自动模式利用共聚焦时间序列扫描方式开始进行时间序列成像（如下图）。

在此设置的时候，除了可以设定漂白激光强度与时间外，还可以设备漂白前拍摄的张数，漂白后拍摄的张数，以及一共需要拍摄多长时间。如上图。拍摄完成后会出来一个时间序列图像。然后窗口栏选择FRET界面分析，

选择受体漂白法Acceptor Photobleaching，入分析界面。

将数据分别代入相应的区域，注意漂白前与漂白后的对话框选入的一定要与实际数据对应。点击New image，则出来一个新的界面。

然后将漂白选择的区域复制这个窗口中，点击软件分析窗口的measurement即可进行计算，

则出来相应的数据结果供分析参考。得到样品应该强度变化及FRET效率，见下图。

当然FRET的测量方法除了利用共聚焦显微镜基于荧光强度的变化来进行计算之外，还可以基于荧光寿命变化来进行计算。

受篇幅限制，本次FRET实验操作流程就介绍到这里。