作者：曹慧珍
“相分离”物理化学领域中的基本概念，这一现象可追溯至鸿蒙初始，盘古开天辟地，清者上升为天，浊者下沉为地。“相分离”也是生物学研究领域的热词，CNS2018年已发表多篇相关报道。细胞中的相分离，细胞内特定分子聚集起来形成液滴形成特定环境加速生物学反应，具有重要的生物学意义。小编不是科研工作者，就不班门弄斧给大家科普“相分离”的重要意义了，大家可以去查阅相关文献。小编是显微镜工作人员哦，可以给大家提供相分离结构研究过程中显微镜图像采集的技术支持！
1. 相分离的基础----确定蛋白质形成液滴的浓度以及液滴的尺寸
这也是显微镜成像中的基础篇哦，设置好成像光路（根据蛋白的荧光标记+TD），采集不同浓度样品的荧光和透射光成像即可。
1.1选择物镜（根据物镜型号确定是否加油加水），点击OC在显微镜目镜下确认样品位置和焦面。
*相变的尺寸是微米级的，所以通常情况下直接选择60X或100X油镜；但对于初学者或者底部厚度>0.17mm的器皿，选择20X物镜，通过zoom后续放大。
1.2点击A1切换至共聚焦显微镜成像，点击[Laser Inter Locked]按钮，解除闪烁状态，使激光可以通过软件解除锁定。
1.3点击打开光路设置窗口
1.4勾选需要的通道（根据蛋白标记的荧光信号），如果观察多种蛋白相分离，根据不同蛋白标记勾选多个通道，点击
按钮，透射光检测器进入光路，同时获取透射图像。
*多通道图像采集时，需注意通道顺序Ch Series，为避免串色，建议选择line41顺序采集模式，如多色荧光相互之间确定不会串色，可选择none模式，提高采集速度。
1.5在Pinhole的项目中点击[▲Home]按钮，选择与物镜最匹配的针孔尺寸。
1.6调整像素数为所需要的分辨率（512×512或1024×1024等），选择扫描速度（信号较弱时，可降低扫描速度，提高信号亮度）。
1.7点击[Live]按钮，先调节至最佳焦面，然后边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。
*提高Laser和HV都可提升图片亮度，但HV过高，噪音增加，信噪比会降低，Laser过高，会带给样品光毒性，不利于多次图像采集，请根据实验目的，合理调整Laser和HV获得最佳成像效果。
1.8根据需要选择Average，提升信噪比。
1.9点击[XY]按钮以获取图像。
1.10菜单栏中选择[File] -> [Save As]保存图像。
2. 液滴融合或分离实验
timelapse时间序列图像采集
2.1重复1.1-1.6
2.2打开PFS完美聚焦系统，较正热漂移带来的焦面变化，保证长时间拍摄焦面稳定性。
2.3点击[Live]按钮，先调节至最佳焦面，然后边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。
2.4根据需要选择Average，提升信噪比。
2.5进入ND Acquisition窗口，勾选T
2.6设置时间间隔（Interval）和持续时间（Duration），Interval需大于单张图像采集时间。
2.7勾选[Save to File]，在采集图像的同时保存图像。
2.8点击[Run now]按钮，获取时间序列图像。
*若液滴运动速度较快，可将Interval设置为no delay，并可通过降低图像分辨率和不选择Average保证采集速度尽量大。
*若液滴容易淬灭，保证亮度信噪比的同时尽量降低激光强度，对于运动较慢的液滴可以设置较长的Interval间隔来降低采图对于荧光染料的淬灭。
Nott, T. J. et al.
3. 细胞或离体环境中液滴的分布
三维序列图像采集
3.1重复1.1-1.8
3.2进入ND Acquisition窗口，勾选Z
3.3点击[Live]按钮，边预览边调节焦面至信号消失，点击[Top]按钮，确定三维图像的顶面
3.4继续预览，反方向调节焦面，信号增强再减弱至消失，点击[Bottom]按钮，确定三维图像底面，停止预览。
3.5输入Step，建议选择推荐值的1-2倍。
3.6勾选[Save to File]，在采集图像的同时保存图像。
3.7点击[Run now]按钮，获取三维序列图像。
3.8点击
[Show Volume View]按钮，构筑三维图像。用鼠标拖动三维图像的边框，以调节到所需的角度。从菜单栏中执行[Edit] -> [Create View Snapshot (8bit RGB)]，获取特定角度的图像。
3.9点击[Show Movie Maker]按钮，开始创建旋转图像，旋转拖拉右侧各种旋转模块进入时间轴，然后点击[Create Movie]按钮创建影像。从菜单栏中选择[File] -> [Save As]将创建的动画保存为avi。
4. 通过FRAP实验研究相分离结构与周围环境的物质交换
4.1重复1.1-1.6
4.2打开PFS完美聚焦系统，较正热漂移带来的焦面变化，保证长时间拍摄焦面稳定性。
4.3点击[Live]按钮，先调节至最佳焦面，然后边观察图像边调节激光功率和检测器的灵敏度HV。
4.4点击图像侧面边框上
的按钮，在图像上绘制ROI。
4.5在ROI上鼠标右击，从弹出的菜单中选择[Use as Stimulation ROI]。
4.6点击Photo Activation，切换设定画面。选择刺激用的激光及激光功率，选择刺激的扫描速度。
4.7点击 [Photo Activation]按钮，启动ND Stimulation窗口。
4.8在ND Stimulation窗口设置FRAP程序，通常我们先添加一条采集程序，采集2-3张漂白前的图像（no delay），然后增加一条刺激程序，该程序的ROI编号需于4.5中一致，最后我们添加一或多条采集程序（采集漂白后恢复图像），Interval和Duration取决于液滴荧光的恢复速度及抗淬灭能力。
4.9点击[Apply Stimulation Settings]按钮，读取光刺激成像的设定。可勾选[Perform Time Measurement]在获取图像的同时获取ROI内荧光信号的时间序列变化图。
4.10点击 [Run now]按钮，执行光刺激成像，获取FRAP图像。
*FRAP实验不是一蹴而就的，整个ND stimulation包含三条及以上程序，#1是约定俗成的采集2-3张图像，记录漂白前的图像，#2和#3都是需要不断尝试的。
#2决定了样品能否被漂白，漂白到什么程度，#3反映了漂白区域的荧光信号恢复速度。在没有相关实验参考的前提下FRAP图像采集建议：
a) 按照以下程序run：刺激用激光功率先设定为100%，刺激速度1s/f，#1 acquisition no delay 2 loops，#2 stimulation S1 no delay 1 loops，#3 acquisition no delay 2 loops。
b) 根据上述结果图像，判断ROI区域是否被漂白，漂白效率是多少，漂白区域是否与ROI区域匹配。若未被漂白或漂白效率不足50%，需提高漂白时间，通过提高Scan speed或#2中loops都可；若漂白效率高于95%或漂白区域大于ROI区域时，需降低刺激时间或刺激光的强度，因#2中loops为1仅可通过降低Scan speed降低漂白时间；多次测试后获取最佳漂白参数。
c) 修改#3， acquisition no delay duration5min，采集一组图像，判断样品信号的恢复速度以及抗淬灭能力。若样品恢复速度非常快，10s内需要调整Scan setting，牺牲一部分图像分辨率以最快的速度采集图像；若样品恢复速度较慢，可设置interval，减少光毒性和数据量；若信号的恢复速度慢且易淬灭，首先需要调整Acquisition参数，降低Laser提高HV，然后必须提高Interval间隔时间。
d) 如想一次性漂白多个区域，建议ROI分别Use as Stimulation ROI 1、2、3而非都Use as Stimulation ROI 1，如果使用后者无法使用一个ROI摸索出的漂白参数，漂白效果未知，还需注意在Photo Activation窗口下勾选all stimulation area set to same，#2中ROIs选择S1,S2,S3。
Sun D, Wu R, Zheng J, Li P, Yu L. Cell research 2018;28:405-15.采集自本平台
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